Оцветяването по грам е бърза техника и се използва, за да се види наличието на бактерии в тъканна проба и да се класифицират бактериите като грам-положителни или грам-отрицателни, въз основа на химичните и физичните свойства на техните клетъчни стени. Оцветяването по Грам почти винаги се използва като първа стъпка при диагностицирането на бактериална инфекция.
Тази техника на оцветяване е кръстена на датския учен Ханс Кристиан Грам (1853 - 1938), който разработва техниката през 1882 г. и я публикува през 1884 г. като техника за разграничаване между два вида бактерии със сходни клинични симптоми: Streptococcus pneumoniae (известен също като Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) и бактерията Klebsiella pneumoniae.
Стъпка
Метод 1 от 3: Подготовка на слайда за микроскоп
Стъпка 1. Подгответе се за работа в лаборатория
Носете ръкавици и дълга вратовръзка за коса, за да предотвратите бактериално замърсяване на пробата, която тествате. Почистете работното пространство под аспиратор или в друго добре проветриво помещение. Проверете горелката на Bunsen и се уверете, че микроскопът работи правилно, преди да започнете.
Стъпка 2. Стерилизирайте стъклото на микроскопа
Ако стъклото се замърси, измийте го със сапунена вода, за да отстраните маслото и замърсяванията. Почистете слайдовете с етанол, почистващ препарат за стъкло или друг метод, използван от вашата лаборатория.
Стъпка 3. Поставете пробата върху стъклото
Можете да използвате техниката на оцветяване по Грам, за да помогнете за идентифицирането на бактерии в медицинска проба или култура от бактерии, растящи в чиния на Петри. За най -добри резултати използвайте петно по Грам върху тънки щрихи на пробата. Препоръчително е да се използват проби на по -малко от 24 часа, тъй като по -старите бактерии може да са повредили клетъчните си стени и да не реагират на оцветяване по Грам.
- Ако използвате тъканна проба, добавете 1-2 капки към стъкло. Разпределете равномерно върху предметното стъкло, за да образувате тънък слой от пробата, като я плъзнете, като използвате ръба на другата стерилна стъклена пързалка. Оставете да изсъхне, преди да направите следващата стъпка.
- Ако вземате бактерии от петриева чиния, стерилизирайте цикъла за инокулация в горелка на Бунзен, докато свети, след което го оставете да се охлади. Използвайте контура, за да капете стерилна вода върху предметното стъкло, след това стерилизирайте и охладете отново, преди да го използвате за събиране на малка проба от бактерии. След това разбъркайте внимателно.
- Бактериите, приготвени в бульона, трябва да се разбъркат отново с помощта на вихрови смесители, след това да се вземат с цикъла на инокулация, както по -горе, без да се добавя вода.
- Ако имате проба от тампон (обикновено се прави с малка дръжка с памучен връх), докоснете и леко завъртете тампона върху пързалката.
Стъпка 4. Малко висока температура може да направи добра намазка
Топлината ще задържи бактериите отгоре на пързалката, така че те не се разтварят лесно по време на процеса на оцветяване. Докоснете пързалката бързо два до три пъти върху горелка Bunsen или загрейте слайда над електрически нагревател. Не прегрявайте, пробата може да се повреди. Ако използвате горелка Bunsen, тя трябва да бъде малък, но син пламък, вместо голям оранжев пламък.
Алтернативно, намазка може да се направи и с метанол, като се добавят 1-2 капки метанол към суха намазка, като се изсуши останалият метанол върху предметното стъкло, като се остави на открито. Тази техника свежда до минимум увреждането на клетките и осигурява чист фон на изображението на слайда
Стъпка 5. Поставете слайда върху тавата за оцветяване
Оцветяващите тави са изработени от метал, стъкло или плитки пластмасови плочи с мека мрежа, облицована отгоре. Поставете диапозитивите върху тези мрежи, така че течността, която използвате, да може да се източи в тавата.
Ако нямате тава за оцветяване, можете да поставите диапозитив върху пластмасова тава, за да отпечатате кубчета лед
Метод 2 от 3: Процес на оцветяване по Грам
Стъпка 1. Изсипете кристално виолетовата течност върху намазката
Използвайте пипета, за да напръскате проба от бактерии с няколко капки кристално виолетова боя, известна още като тинтява виолетова. Оставете за 30-60 секунди. Кристално виолетовото (KV) се отделя във воден разтвор на KV+ и хлоридни (Cl-) йони. Тези йони проникват в клетъчните стени и клетъчните мембрани на грам-положителни и грам-отрицателни бактерии. Йонът KV+ взаимодейства с отрицателно заредените компоненти на бактериалните клетки, придавайки на клетките лилав цвят.
Много лаборатории използват кристално виолетово "Hucker", което съдържа амониев оксалат за предотвратяване на валежите
Стъпка 2. Изплакнете внимателно кристално виолетовото
Наклонете пързалката и използвайте бутилка за измиване, за да напръскате малка струя дестилирана или чешмяна вода върху пързалката. Водата трябва да се стича по повърхността на намазката и не трябва да се напръсква директно върху намазката. Не изплаквайте прекомерно. Може да премахне оцветяването при грам -положителни бактерии.
Стъпка 3. Изплакнете намазката с йод, след което изплакнете
Използвайте капкомер, за да промиете намазката с йод. Оставете го да действа поне 60 секунди, след което изплакнете внимателно по същия начин, както по-горе.) във вътрешния и външния слой на клетката. Този комплекс от съединения ще запази виолетовия цвят на кристално виолетовия в клетката, на оцветените места.
Йодът е корозивно вещество. Избягвайте вдишване, поглъщане или контакт с кожата
Стъпка 4. Добавете избелващ цвят, след което изплакнете бързо
За тази важна стъпка обикновено се използва смес от ацетон и етанол в съотношение 1: 1, която трябва да бъде внимателно определена. Поставете пързалката под определен ъгъл, след това добавете цветен избелващ агент, докато във водата, използвана за изплакване, не се вижда повече лилаво. Това обикновено отнема по -малко от 10 секунди или дори по -малко време, ако белина съдържа висока концентрация на ацетон. Спрете тази стъпка незабавно, в противен случай багрилото също ще извлече кристално виолетово от грам-положителните и отрицателните клетки и процесът на оцветяване трябва да се повтори. Незабавно изплакнете излишния цвят белина, използвайки предишната техника.
- Чист ацетон (95%+) може да се използва като заместител. Колкото повече ацетон използвате, толкова по -бързо ще действа белина, така че трябва да обърнете повече внимание на времето.
- Ако имате проблеми с проследяването на времето за тази стъпка, добавете капка по капка цветен избелващ агент.
Стъпка 5. Поръсете контра-багрилото върху намазката, след което изплакнете
Противооцветяване, обикновено сафранин или фуксин, се използва за увеличаване на контраста между грам-отрицателни и грам-положителни бактерии, чрез оцветяване на обезцветени (обезцветени) бактерии, т.е. грам-отрицателни бактерии, розови или червени. Оставете за поне 45 секунди, след това изплакнете.
Фуксинът интензивно ще оцвети много грам-отрицателни бактерии, като Haemophilus spp и Legionella spp. Този метод е подходящ за начинаещи
Стъпка 6. Изсушете пързалката
Можете да ги изсушите на открито, за да изсъхнат, или да ги изсушите с бибулозна хартия, продавана за тази цел. Процесът на оцветяване по Грам е завършен.
Метод 3 от 3: Проверка на резултатите от оцветяването
Стъпка 1. Подгответе светлинния микроскоп
Поставете предметното стъкло под микроскопа. Бактериите се различават значително по размер, така че общото необходимо увеличение ще варира от 400x до 1000x. За по -рязко изображение се препоръчва обектив с обектив с потапящо масло. Капете потапящото масло върху пързалката, като избягвате движение, докато капе, за да предотвратите образуването на мехурчета.
Потапянето с масло може да се използва само върху специално проектирани лещи, а не върху "сухи" лещи
Стъпка 2. Опитайте се да идентифицирате грам положителни и грам отрицателни бактерии
Разгледайте слайда под светлинен микроскоп. Грам-положителните бактерии изглеждат лилави на цвят, тъй като кристално виолетовото е уловено в дебелата клетъчна стена. Грам-отрицателните бактерии ще бъдат розови или червени на цвят, тъй като кристално виолетовото се изплаква през тънките клетъчни стени, където навлиза розовото контрабагрило.
- Ако пробата е твърде дебела, резултатът може да е фалшиво положителен. Оцветете нова проба, ако тя показва всички грам положителни бактерии, за да се уверите, че резултатът е правилен.
- Ако използвате прекалено много избелващо средство, резултатът може да бъде фалшиво отрицателен. Оцветете нова проба, ако тя показва всички грам отрицателни бактерии, за да се уверите, че резултатът е правилен.
Стъпка 3. Сравнете резултатите, които виждате с референтното изображение
Ако не знаете как изглеждат бактериите, проучете колекцията от референтни изображения, обикновено сортирани по форма и петно по Грам. Можете също да видите онлайн бази данни в [Национална база данни за микроби, патогени в снимки и много други онлайн сайтове. За да се улесни идентификацията, по -долу са дадени примери за бактерии, които са често срещани или важни за диагностициране, класифицирани според техния статус и форма на Грам.
Стъпка 4. Идентифицирайте грам-положителни бактерии въз основа на тяхната форма
По -нататък бактериите се класифицират според формата им под микроскопа, най -често като коки (сферични) или пръчки (цилиндрични). Ето някои примери за грам-положителни бактерии (лилаво на цвят) според тяхната форма:
- Грам положителни коки обикновено стафилококи (което означава група коки) или стрептококи (което означава верига коки).
- „Грам положителни пръчици като Bacillus, Clostridium, Corynebacterium и Listeria. Пръчковите бактерии Actinomyces spp. обикновено имат клони или нишки.
Стъпка 5. Идентифицирайте грам отрицателни бактерии
Грам-отрицателните бактерии (розови на цвят) често се класифицират в три групи. Коките имат сферична форма, пръчките са дълги и тънки, докато кокоидните пръчки са между тях.
- Грам отрицателни коки Най -често срещаният е Neisseria spp.
- Грам-отрицателни пръчки напр. Е. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas и много други. Vibrio cholerae може да се разглежда като редовно стъбло или огънато стъбло.
- Грам-отрицателни "кокоидни" (или "кокобацили") бактерии от пръчици например Bordetella, Brucella, Haemophilus и Pasteurella
Стъпка 6. Проверете внимателно дали резултатите са смесени
Някои бактерии трудно се оцветяват, поради крехкостта или восъчната природа на клетъчните им стени. Тези бактерии могат да показват смес от лилаво или розово в една и съща клетка или между различни клетки в една и съща намазка. Бактериалните проби, по -стари от 24 часа, могат да покажат този проблем, но има и някои бактериални видове, които остават трудни за оцветяване на всяка възраст за вземане на проби. Тези бактерии изискват по-специализирани тестове за идентификация, като киселинно-бързо оцветяване, наблюдение в бактериална култура, TSI културална среда или генетично изследване.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium и Propionibacterium spp. всички са грам-положителни бактерии, но често не са ясно оцветени.
- Малки, тънки бактерии като Treponema, Chlamydia и Rickettsia spp. трудно оцветяване по метода на Грам.
Стъпка 7. Изхвърлете останалите консумативи и оборудване
Тази процедура за изхвърляне на отпадъци варира в различните лаборатории и зависи от използваните материали. Обикновено течността в оцветяващата тава се изхвърля в бутилки, обозначени като опасни отпадъци. Накиснете слайдовете в 10% разтвор на белина, след това изхвърлете в контейнер за остри предмети.
Съвети
- Не забравяйте, че резултатите от оцветяване по Грам ще бъдат добри само ако пробата е добра. Важно е да информирате пациентите, за да могат да предоставят добър образец (например разликата между плюене и дълбока кашлица за получаване на проба от храчки).
- Като цветно избелващо средство, етанолът реагира по -бавно от ацетона.
- Придържайте се към стандартните лабораторни разпоредби, за да осигурите безопасност.
- Използвайте тампон за бузите, за да практикувате, защото той съдържа както грам-положителни, така и грам-отрицателни бактерии. Ако видите само един вид бактерии, може да използвате твърде малко или твърде много белина.
- Можете да използвате дървени закопчалки за закрепване на пързалката.
Внимание
- Ацетонът и етанолът са запалими вещества. Ацетонът ще премахне маслото от ръцете ви, което ще улесни кожата ви да абсорбира други химикали. Носете ръкавици и ги използвайте внимателно.
- Не позволявайте на намазката да изсъхне, преди да изплакнете петното по Gram или контрабезката.
От какво имаш нужда
- Мрежова проба
- Стъклен пързалка
- Пипета
- Малък източник на огън, нагревател или метанол
- Вода
- Кристално виолетово
- Йод
- Цветна белина, като алкохол или ацетон
- Сафранин
